Geni controllati dal fattore di trascrizione Xrx1: analisi del "pattern" d'espressione ed implicazioni funzionali

Lo sviluppo dell’occhio dei Vertebrati richiede una serie di eventi correlati, che includono la specificazione della piastra neurale anteriore, l’espansione bilaterale di tessuto dal prosencefalo precoce, al fine di formare le vescicole ottiche, il differenziamento cellulare del cristallino e della retina. Tra i diversi fattori di trascrizione che si esprimono nella regione anteriore della piastra neurale, nota come “eye field”, il gene “homeobox” di tipo “paired-like” Xrx1 gioca un ruolo chiave nella formazione dell’occhio. Nel sistema modello Xenopus laevis, Xrx1 inizia ad essere espresso allo stadio di sviluppo di neurula, nell’intera regione proliferativa della piastra neurale anteriore; La sua espressione accompagna poi tutto lo sviluppo dell’occhio man mano che le vescicole ottiche si allontanano dal diencefalo e si differenziano in coppe ottiche. Al termine del processo di retinogenesi, l’espressione di Xrx1 è ristretta alla sola zona marginale ciliare, dove esplica un’azione di controllo della proliferazione e del mantenimento della multipotenza dei progenitori retinici. All’interno di un progetto volto a individuare i geni possibilmente regolati dal fattore di trascrizione Xrx1, sono stati usati microarray commerciali Genechip Xenopus laevis genome array, per valutare i cambiamenti dei livelli di espressione genica nell’embrione, successivamente al guadagno e alla perdita di funzione di Xrx1 stesso. Nell’insieme dei geni differenzialmente espressi nelle due condizioni, sono stati così individuati una serie di trascritti la cui espressione varia sia nella sovraespressione che nella inattivazione funzionale di Xrx1, condizione che li rende buoni candidati per la loro regolazione, diretta o indiretta, da parte di Xrx1. Da questa lista sono stati poi ulteriormente selezionati i trascritti che mostravano un aumento nella sovraespressione e una diminuzione nell’inattivazione funzionale, o viceversa. Lo scopo di questa tesi è fornire una prima validazione dei dati ottenuti dagli esperimenti di microarray, analizzando il “pattern” di espressione di una selezione di trascritti il cui livello di espressione aumenta nella sovraespressione e diminuisce nell’inattivazione funzionale o viceversa. Al contempo è stato analizzato anche il “pattern” di espressione di alcuni particolari trascritti differenzialmente espressi solo negli esperimenti di guadagno di funzione. Sono stati scelti ed analizzati dodici trascritti in totale, due dei quali corrispondenti rispettivamente al fattore di trascrizione Xotx5b e al ligando transmembrana per recettori tirosina-kinasi EphrinB1. Al fine di analizzare il “pattern” di espressione dei trascritti selezionati, sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ su embrioni interi “wild type” a cinque diversi stadi di sviluppo. In particolare, per verificare l’espressione all’interno della retina ,sono state anche eseguite ibridazioni in situ su sezioni di embrioni “wild type” ad uno stadio di sviluppo più tardivo, in cui il processo di retinogenesi è terminato. Inoltre, per confermare i dati dei microarray con un saggio funzionale, ho eseguito ibridazioni in situ su embrioni microiniettati con mRNA sintetico di Xrx1 usando sonde corrispondenti ad alcuni dei trascritti selezionati. Dalle analisi di ibridazione su embrioni interi, tutti i trascritti analizzati presentano domini di espressione sovrapponibili a quelli di Xrx1 almeno in uno degli stadi di sviluppo analizzati. L’analisi di ibridazione su sezione, ha mostrato che sei trascritti risultano chiaramente espressi nella zona marginale ciliare della retina, mentre quattro trascritti sono espressi più debolmente nella stessa regione. Le analisi di ibridazione di quattro trascritti su embrioni microiniettati con mRNA sintetico di Xrx1 hanno prodotto risultati in accordo con i dati dei microarray per due trascritti su quattro. Questi risultati suggeriscono che i trascritti selezionati, avendo un dominio di espressione localizzato negli occhi e parzialmente o totalmente sovrapponibile a quello di Xrx1, possono essere considerati come dei buoni candidati per essere effettivamente regolati da tale fattore di trascrizione